#mRNA#
注:本文不构成任何投资意见和建议,以官方/公司公告为准;本文仅作医疗健康相关药物介绍,非治疗方案推荐(若涉及),不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。
前言
前情回顾:mRNA质量分析系列已发布3期,既往菌菌探讨了加帽率、polyA尾分布和dsRNA的检测方法,感兴趣的小伙伴可直接戳链接查看:mRNA质量分析系列Part1:基于RNaseH或核酶的加帽率检测方法;Part2:基于LC-MS或测序平台的polyA尾检测方法;Part3:dsRNA检测方法
耀海生物mRNA质量分析系列Part4继续为大家分享:残留DNA检测方法。
mRNA药物的制备流程包括模板DNA制备、mRNA原液制备和成品制备,其中DNA原液的制备过程中,需借助大肠杆菌作为宿主细胞扩增质粒DNA,线性化的质粒DNA作为体外转录(IVT)的模板,因此,模板DNA中可能有宿主细胞DNA的残留、mRNA原液可能存在质粒DNA模板的残留,可能引发药物安全性问题。
为监测生物制品的生产工艺,确保其质量稳定性和安全性,国内外监管机构建立了生物制品残留DNA的检测标准和检测方法。
在这篇文章中,菌菌将参考中美欧药典,详细介绍残留DNA的检测方法。
一、国内外药典中检测方法的异同
由于不同检测方法的灵敏度和特异性不同,国内外药典收录的残留DNA检测方法也不尽相同。年版的中国药典记录了三种残留DNA测定方法:DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法;美国药典推荐DNA探针杂交法、DNA结合蛋白免疫阈值法和实时定量PCR法用于残留DNA的检测;欧洲药典介绍了两种检测方法:实时定量PCR法和免疫酶法,如下表所示:
二、残留DNA检测方法概述
1.定量PCR法(qPCR)
1.1基于荧光探针的qPCR法
检测原理:
PCR反应过程中可通过荧光标记的特异性探针检测PCR产物量。带有一对荧光分子的探针与样品中DNA通过碱基互补配对的原则结合,随着PCR反应的进行,Taq聚合酶合成DNA,同时沿5’-3’方向水解DNA探针,一对荧光分子随着探针的水解而分开,发出荧光信号。通过连续监测反应体系中荧光读数的变化,可即时反映特异性扩增产物量的变化。在反应过程中所释放的荧光强度达到预设的阈值时,体系的PCR循环数(Ct值)与该体系所含的起始DNA模板量的对数值呈线性关系。采用已知浓度的DNA标准品构建标准曲线,由此计算样品中的DNA残留量。
检测方法:
(1)设计探针引物、准备标准品和待测样品。
(2)配制不含模板的PCR混合液:引物和探针进行适当稀释,根据试剂说明书配制。
(3)添加模板:分别加入无核酸酶水、待测样品、DNA标准品溶液(0.至pg/μl,每十倍一个梯度)作为PCR模板,每个样品设3个复孔。另设无核酸酶水为空白对照。
(4)设置PCR程序:将反应板放置在荧光定量PCR仪中,根据序列特性设定PCR反应参数。
(5)结果计算:取第3至15次循环的荧光强度均值加10倍标准差,或采用阴性对照荧光值的最高点作为荧光阈值。以至少5个连续标准品溶液浓度点生成标准曲线,得到线性回归方程(R2≥0.98),斜率在-3.1至-3.8之间,将样品溶液的Ct值代入线性回归方程,计算样品中DNA残留量。
1.2基于荧光染料的qPCR法
检测原理:PCR反应过程中,通过在DNA双链中掺入荧光分子以定量分析PCR产物量。游离的荧光染料几乎没有荧光信号,但结合双链DNA后,其荧光信号大幅增强,且荧光信号强度与DNA分子的数量成正比。
检测方法:
(1)向PCR反应体系中加入能掺入DNA双链的荧光分子。
(2)根据序列特性设定如下PCR反应程序,DNA开始扩增,荧光分子掺入DNA分子中并发射荧光信号。
(3)根据荧光信号定量分析DNA的扩增量及模板DNA含量。
图1:基于荧光染料(左)或荧光探针(右)的qPCR原理
星耀小TIP:
①引物设计可使用PrimerPremier5和Oligo7等软件,设计原则包括:产物长度~bp,3’端最后一个碱基优先使用G或C,避免使用T;建议正反向引物的Tm值相差不超过1℃;GC含量在40%-60%。
②探针设计原则包括:Tm值比引物Tm值高5-8℃,常使用65-67℃,避免连续出现相同碱基,尤其是连续的G。
③DNA标准品含量在0.01-pg/μl范围内(取决于标准曲线),该方法线性较好,当DNA残留量低于标准曲线最低浓度点时,应为限量测定。
2.DNA探针杂交法
检测原理:样品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上(如硝酸纤维素膜或尼龙膜),在一定条件下可与特异性标记的单链DNA探针退火复性,杂交形成双链DNA,在膜上形成斑点,斑点信号与DNA含量成正比,可通过相应的显示系统检测,与已知含量的阳性DNA对照比对后,可计算样品中DNA残留量。
检测方法:
(1)制备用于探针标记和阳性对照的DNA:用于探针标记和阳性对照的DNA,由生产样品用的工程菌提取纯化获得。
(2)蛋白酶K对稀释后的样品、阳性对照和阴性对照进行预处理。
(3)点膜:用TE缓冲液浸润杂交膜后,将预处理的样品、阳性对照、阴性对照与空白对照置于℃水浴加热10分钟,迅速冰浴冷却,以rpm离心5秒。用抽滤加样器点样于杂交膜,晾干后可采用紫外交联法或置80℃真空干烤1小时以上。
(4)杂交、显色与结果判定:阳性对照显色,且颜色深度与DNA含量呈一定的梯度;阴性对照、空白对照应不显色,或显色深度小于阳性DNA对照最低浓度,则试验成立。将样品与阳性对照进行比较,根据显色程度计算样品的DNA含量。
注意事项:
中国药典对样品及阳性对照的稀释提示如下:
①样品的稀释:根据成品最大使用剂量,用DNA稀释液将样品(原液)稀释至每μl含1人份剂量;如成品最大使用剂量较大,且蛋白质含量较低,可将样品稀释至每μl含1/10或1/人份剂量。
②阳性DNA对照的稀释:用DNA稀释液稀释至ng/ml,然后依次10倍稀释成10ng/μl、1ng/μl、pg/μl;如成品使用剂量较大,而且DNA限量要求(pg/剂)较严格时,则需要提高DNA检测灵敏度,相应的阳性DNA对照应稀释成pg/μl、10pg/μl、1pg/μl.
3.荧光染色法
检测原理:使用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物,在波长nm激发下产生荧光信号,可用荧光酶标仪在波长nm处进行检测,在该荧光染料过量的情况下,在一定的DNA浓度范围内,荧光强度与DNA浓度成正比,根据样品的荧光强度,计算样品中的DNA残留量。
检测方法:
(1)分别取DNA标准品(0,1.25-80ng/ml)和样品于离心管中,加入新配制的双链DNA荧光染料,混匀避光放置。
(2)荧光酶标仪检测上述反应液的荧光强度,以TE缓冲液测得的荧光强度为本底。
(3)以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作线性回归,求得线性回归方程(相关系数应不低于0.99),将样品溶液的荧光强度代入线性回归方程,计算样品中DNA残留量。
注意事项:DNA残留量在1.25-80ng/ml范围内,线性较好,当DNA残留量低于标准曲线最低浓度点时,应为限量测定。
4.DNA结合蛋白免疫阈值法(也称免疫酶法)
检测原理:样品中DNA加热变性为单链DNA,与链霉亲和素标记的单链DNA(ssDNA)结合蛋白结合,同时脲酶偶联的抗ssDNA单抗与ssDNA结合蛋白结合,形成含有DNA-链霉亲和素-脲酶的复合物,可被生物素化膜捕获,并可与尿素反应产生氨,引起溶液pH值的变化,pH值的变化与样品中DNA含量成正比。
检测方法:
(1)样品中DNA加热变性为单链DNA,与含有链霉亲和素偶联的ssDNA结合蛋白和脲酶偶联的抗ssDNA单抗的试剂混合。
(2)样品经生物素化膜过滤,特异性捕获DNA-链霉亲和素-脲酶复合物,随后洗去非特异性结合的试剂。
(3)酶法反应:将膜放入含有尿素溶液的传感器中,发生酶促反应,产生氨,监测其pH值的变化。
(4)软件分析:根据标准品和样品的原始数据,绘制标准曲线,计算残留DNA含量。
星耀小TIP:
残留DNA的检测中,需要以mg级的样品用于精确定量pg级的DNA,样品中蛋白质和其他化学试剂可能影响检测结果,应针对不同特性的样品选择合适的预处理方式,常用的方法有蛋白酶消化和DNA抽提。
三、结语
在选择合适的残留DNA检测方法时,需结合样品的特征考虑检测方法的灵敏度和特异性。灵敏度方面,DNA探针杂交法可特异性检测目标DNA,如果肉眼评估斑点大小,可半定量测定,结合成像仪等精密系统可实现较为精确的定量检测。荧光染色法、DNA结合蛋白免疫阈值法与qPCR法可定量检测DNA残留水平,结果较为精确,可用于过程检测和控制。
序列特异性方面,DNA探针杂交法可使用针对DNA来源设定随机标记,或针对特定序列合成探针,可在不同的使用场景下表现出DNA来源特异性或序列特异性。荧光染色法和DNA结合蛋白免疫阈值法分别靶向双链DNA和单链DNA,不具备序列特异性,因此在检测过程中应避免环境和人员污染造成的结果偏差。q-PCR探针靶向目标序列设计,序列特异性较强,其特异性序列必须是高度保守的DNA区域内的稳定序列,以检测样本中所有残留DNA。
结合灵敏性、特异性与耗时短,qPCR是宿主DNA及DNA模板残留的常用检测方法。在宿主DNA残留的检测中,可根据中国药典的推荐设计qPCR引物与探针,如下图所示。而针对模板DNA的检测可根据序列特性设计引物,如选择抗生素基因、质粒复制起点(ORI,originofreplication)等序列。
图2:中国药典推荐的大肠杆菌DNA残留检测用探针及引物
参考文献:
[1]国家药典委员会.中国药典..
[2]TheUnitedStatesPharmacopieialConvention.TheUnitedStatesPharmacopeia.
[3]EuropeanPharmacopoeiaCommission.EuropeanPharmacopoeia10.0.
[4]CaoY,YuM,DongG,etal.DigitalPCRasanEmergingToolforMonitoringofMicrobialBiodegradation.Molecules.Feb6;25(3):.doi:10./molecules25030.
[5]药品审评中心.新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行)..
[6]USP.AnalyticalProceduresformRNAVaccines–Draft..