#mRNA#
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前言
前情回顾：mRNA质量分析系列已发布3期，既往菌菌探讨了加帽率、polyA尾分布和dsRNA的检测方法，感兴趣的小伙伴可直接戳链接查看：mRNA质量分析系列Part1：基于RNaseH或核酶的加帽率检测方法；Part2：基于LC-MS或测序平台的polyA尾检测方法；Part3：dsRNA检测方法
耀海生物mRNA质量分析系列Part4继续为大家分享：残留DNA检测方法。
mRNA药物的制备流程包括模板DNA制备、mRNA原液制备和成品制备，其中DNA原液的制备过程中，需借助大肠杆菌作为宿主细胞扩增质粒DNA，线性化的质粒DNA作为体外转录（IVT）的模板，因此，模板DNA中可能有宿主细胞DNA的残留、mRNA原液可能存在质粒DNA模板的残留，可能引发药物安全性问题。
为监测生物制品的生产工艺，确保其质量稳定性和安全性，国内外监管机构建立了生物制品残留DNA的检测标准和检测方法。
在这篇文章中，菌菌将参考中美欧药典，详细介绍残留DNA的检测方法。
一、国内外药典中检测方法的异同
由于不同检测方法的灵敏度和特异性不同，国内外药典收录的残留DNA检测方法也不尽相同。年版的中国药典记录了三种残留DNA测定方法：DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法；美国药典推荐DNA探针杂交法、DNA结合蛋白免疫阈值法和实时定量PCR法用于残留DNA的检测；欧洲药典介绍了两种检测方法：实时定量PCR法和免疫酶法，如下表所示：
二、残留DNA检测方法概述
1.定量PCR法（qPCR）
1.1基于荧光探针的qPCR法
检测原理：
PCR反应过程中可通过荧光标记的特异性探针检测PCR产物量。带有一对荧光分子的探针与样品中DNA通过碱基互补配对的原则结合，随着PCR反应的进行，Taq聚合酶合成DNA，同时沿5’-3’方向水解DNA探针，一对荧光分子随着探针的水解而分开，发出荧光信号。通过连续监测反应体系中荧光读数的变化，可即时反映特异性扩增产物量的变化。在反应过程中所释放的荧光强度达到预设的阈值时，体系的PCR循环数(Ct值)与该体系所含的起始DNA模板量的对数值呈线性关系。采用已知浓度的DNA标准品构建标准曲线，由此计算样品中的DNA残留量。
检测方法：
（1）设计探针引物、准备标准品和待测样品。
（2）配制不含模板的PCR混合液：引物和探针进行适当稀释，根据试剂说明书配制。
（3）添加模板：分别加入无核酸酶水、待测样品、DNA标准品溶液（0.至pg/μl，每十倍一个梯度）作为PCR模板，每个样品设3个复孔。另设无核酸酶水为空白对照。
（4）设置PCR程序：将反应板放置在荧光定量PCR仪中，根据序列特性设定PCR反应参数。
（5）结果计算：取第3至15次循环的荧光强度均值加10倍标准差，或采用阴性对照荧光值的最高点作为荧光阈值。以至少5个连续标准品溶液浓度点生成标准曲线，得到线性回归方程（R2≥0.98），斜率在-3.1至-3.8之间，将样品溶液的Ct值代入线性回归方程，计算样品中DNA残留量。
1.2基于荧光染料的qPCR法
检测原理：PCR反应过程中，通过在DNA双链中掺入荧光分子以定量分析PCR产物量。游离的荧光染料几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号大幅增强，且荧光信号强度与DNA分子的数量成正比。
检测方法：
（1）向PCR反应体系中加入能掺入DNA双链的荧光分子。
（2）根据序列特性设定如下PCR反应程序，DNA开始扩增，荧光分子掺入DNA分子中并发射荧光信号。
（3）根据荧光信号定量分析DNA的扩增量及模板DNA含量。
图1:基于荧光染料（左）或荧光探针（右）的qPCR原理
星耀小TIP：
①引物设计可使用PrimerPremier5和Oligo7等软件，设计原则包括：产物长度~bp，3’端最后一个碱基优先使用G或C，避免使用T；建议正反向引物的Tm值相差不超过1℃；GC含量在40%-60%。
②探针设计原则包括：Tm值比引物Tm值高5-8℃，常使用65-67℃，避免连续出现相同碱基，尤其是连续的G。
③DNA标准品含量在0.01-pg/μl范围内（取决于标准曲线），该方法线性较好，当DNA残留量低于标准曲线最低浓度点时，应为限量测定。
2.DNA探针杂交法
检测原理：样品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上（如硝酸纤维素膜或尼龙膜），在一定条件下可与特异性标记的单链DNA探针退火复性，杂交形成双链DNA，在膜上形成斑点，斑点信号与DNA含量成正比，可通过相应的显示系统检测，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可计算样品中DNA残留量。
检测方法：
（1）制备用于探针标记和阳性对照的DNA：用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产样品用的工程菌提取纯化获得。
（2）蛋白酶K对稀释后的样品、阳性对照和阴性对照进行预处理。
（3）点膜：用TE缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的样品、阳性对照、阴性对照与空白对照置于℃水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却，以rpm离心5秒。用抽滤加样器点样于杂交膜，晾干后可采用紫外交联法或置80℃真空干烤1小时以上。
（4）杂交、显色与结果判定：阳性对照显色，且颜色深度与DNA含量呈一定的梯度；阴性对照、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照最低浓度，则试验成立。将样品与阳性对照进行比较，根据显色程度计算样品的DNA含量。
注意事项：
中国药典对样品及阳性对照的稀释提示如下：
①样品的稀释：根据成品最大使用剂量，用DNA稀释液将样品（原液）稀释至每μl含1人份剂量；如成品最大使用剂量较大，且蛋白质含量较低，可将样品稀释至每μl含1/10或1/人份剂量。
②阳性DNA对照的稀释：用DNA稀释液稀释至ng/ml，然后依次10倍稀释成10ng/μl、1ng/μl、pg/μl；如成品使用剂量较大，而且DNA限量要求（pg/剂）较严格时，则需要提高DNA检测灵敏度，相应的阳性DNA对照应稀释成pg/μl、10pg/μl、1pg/μl.
3.荧光染色法
检测原理：使用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物，在波长nm激发下产生荧光信号，可用荧光酶标仪在波长nm处进行检测，在该荧光染料过量的情况下，在一定的DNA浓度范围内，荧光强度与DNA浓度成正比，根据样品的荧光强度，计算样品中的DNA残留量。
检测方法：
（1）分别取DNA标准品（0,1.25-80ng/ml）和样品于离心管中，加入新配制的双链DNA荧光染料，混匀避光放置。
（2）荧光酶标仪检测上述反应液的荧光强度，以TE缓冲液测得的荧光强度为本底。
（3）以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作线性回归，求得线性回归方程（相关系数应不低于0.99），将样品溶液的荧光强度代入线性回归方程，计算样品中DNA残留量。
注意事项：DNA残留量在1.25-80ng/ml范围内，线性较好，当DNA残留量低于标准曲线最低浓度点时，应为限量测定。
4.DNA结合蛋白免疫阈值法（也称免疫酶法）
检测原理：样品中DNA加热变性为单链DNA，与链霉亲和素标记的单链DNA（ssDNA）结合蛋白结合，同时脲酶偶联的抗ssDNA单抗与ssDNA结合蛋白结合，形成含有DNA-链霉亲和素-脲酶的复合物，可被生物素化膜捕获，并可与尿素反应产生氨，引起溶液pH值的变化，pH值的变化与样品中DNA含量成正比。
检测方法：
（1）样品中DNA加热变性为单链DNA，与含有链霉亲和素偶联的ssDNA结合蛋白和脲酶偶联的抗ssDNA单抗的试剂混合。
（2）样品经生物素化膜过滤，特异性捕获DNA-链霉亲和素-脲酶复合物，随后洗去非特异性结合的试剂。
（3）酶法反应：将膜放入含有尿素溶液的传感器中，发生酶促反应，产生氨，监测其pH值的变化。
（4）软件分析：根据标准品和样品的原始数据，绘制标准曲线，计算残留DNA含量。
星耀小TIP：
残留DNA的检测中，需要以mg级的样品用于精确定量pg级的DNA，样品中蛋白质和其他化学试剂可能影响检测结果，应针对不同特性的样品选择合适的预处理方式，常用的方法有蛋白酶消化和DNA抽提。
三、结语
在选择合适的残留DNA检测方法时，需结合样品的特征考虑检测方法的灵敏度和特异性。灵敏度方面，DNA探针杂交法可特异性检测目标DNA，如果肉眼评估斑点大小，可半定量测定，结合成像仪等精密系统可实现较为精确的定量检测。荧光染色法、DNA结合蛋白免疫阈值法与qPCR法可定量检测DNA残留水平，结果较为精确，可用于过程检测和控制。
序列特异性方面，DNA探针杂交法可使用针对DNA来源设定随机标记，或针对特定序列合成探针，可在不同的使用场景下表现出DNA来源特异性或序列特异性。荧光染色法和DNA结合蛋白免疫阈值法分别靶向双链DNA和单链DNA，不具备序列特异性，因此在检测过程中应避免环境和人员污染造成的结果偏差。q-PCR探针靶向目标序列设计，序列特异性较强，其特异性序列必须是高度保守的DNA区域内的稳定序列，以检测样本中所有残留DNA。
结合灵敏性、特异性与耗时短，qPCR是宿主DNA及DNA模板残留的常用检测方法。在宿主DNA残留的检测中，可根据中国药典的推荐设计qPCR引物与探针，如下图所示。而针对模板DNA的检测可根据序列特性设计引物，如选择抗生素基因、质粒复制起点（ORI,originofreplication）等序列。
图2:中国药典推荐的大肠杆菌DNA残留检测用探针及引物
参考文献：
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